邢台市太和生物化学技术有限公司

以DNA做为支架的酶会表现出不同的动力学特性；然而，这种现象背后的机制仍旧有待探究。我们使用凝血酶研究这个问题，该酶是变构调节丝氨酸蛋白酶模型，以独体的结构和电荷特征嵌入DNA折纸结构（称为DNA Origami)。底物仅在电荷不同时，我们比较酶对底物的水解活性，该电荷不同是由于远离催化位点的末端残基引起，推测该差异涉及到凝血酶的变构活性。我们的数据表明，酶促反应速率受DNA/底物电荷互作的影响，与DNA/酶的连接程度成比例。当与自由扩散的酶相比，带有相反电荷的底物，将会导致以DNA为支架的凝血酶的催化应答产生转变。因此，通过改变嵌入酶周围的电荷环境的方式，DNA纳米结构赋予了酶-底物识别的电荷依赖性机制，可以用于为通过空间限制调节变构的过程提供一种替代性的方法。

01

背景介绍

核酸，尤其是DNA，通常用于分离，重组以及，一般来说，控制蛋白的活性，以揭示自然机制，便于为我们所用。在关于DNA-酶系统中的大量发现中，一个共同的事实是：当一个酶分子与核酸连接，催化反应的速率便发生改变。这种现象，最初被发现是在二十年前，随着DNA纳米技术的进步，虽进一步被研究，但是仍旧缺少综合性的解释。关于这个方向的报道，大多数都强调一旦酶和DNA纳米结构结合，酶的催化活性便被提高。然而，早期的关于DNA-酶复合物的研究展示了相反的结果，发现酶与DNA结合后，催化速率将产生下降。在这两种不同的结果中，改变的程度不仅受DNA链序列和长度的影响，而且受到酶和底物类型的影响，因此问题也变得更加复杂。另一种相关性是，目前为止，关于这个问题的大多数研究进展都采用酶的级联反应（通常为葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶）和DNA纳米结构相结合的方式。参与级联反应的组分以纳米级别的精确度被整合在DNA表面，提供了一种手段，用于将系统中的酶活性表现与其中各成分之间的距离联系起来。在较短的酶内空间下观察到的速率增加，可归因于底物通道效应的发生。

其他研究则表明，DNA 表面所产生的静电效应对于酶的固定起到了重要作用，并提出了其他可能的解释，这些解释在底物扩散速率竞争性较高的情况下尤其适用。

完善的机制仍旧很难描绘，多种假说已经提出来用于解释DNA-酶的催化活性表现。这些包括DNA链和酶和/或底物的直接互作；在蛋白催化位附近提高底物的局部浓度，或者是有利的熵贡献的结果，或者是静电荷驱动的效应；PH梯度的形成；或者是DNA-蛋白界面有序的水化层的形成。所有这些假设均经过实验验证；然而，DNA对与单链DNA连接的酶的活性作用仍旧没有完全揭示，并且难以进行概括。

当下，我们使用凝血酶作为问题研究的模型。凝血酶是胆汁肽酶家族中的单体丝氨酸蛋白酶，能够裂解肽底物，尤其是在碱性残基，大多数是精氨酸残基后发挥作用。两个远离催化中心的次级阴离子结合位点是提高底物的特异性所必须的，合成的核酸适配体以nmol级别的亲和性与这些表位结合。我们使用与凝血酶结合的适配体将凝血酶连接到各种DNA纳米结构上。这种方法已经被广泛的报道，提供了一种通过非共价连接将酶固定到靶向支架的方式。这种方式能够绕过DNA-蛋白共价结合带来的共同问题，比如样本的异质性，蛋白表面永久的化学修饰，这些都可能造成酶结构和功能不可预知的改变。最后，由于我们的系统是由每个 DNA 支架上的单个酶分子构成的，多酶级联反应中那些与距离相关的参数变得不再适用了，简化了数据分析，并且能够深入探讨关于DNA限制型酶促催化这一核心问题。

凝血酶的独特之处在于，在稍有不同的条件下，其催化反应会呈现出多种表现形式，这种可塑性被解释为一种高度受调控的别构激活机制所导致的结果。盐例子类型和浓度，缓冲液的pH值以及与凝血酶表位相互作用的肽底物的末端残基的轻微改变都会导致Kcat值超过100倍的变化，KM值发生三个数量级的变化。由于对结构和电荷相关因素极为敏感，因此凝血酶是检验 DNA 在离子响应性酶反应中的支架作用和静电作用的理想选择，正如那些被多种丝氨酸蛋白酶所调节的那样。这些DNA相关的效应在动力学不稳定的系统中仍旧不清楚，对其的深入理解在开发酶活性调节的替代性工具上因而十分重要。

通过在不同缓冲液条件和DNA微环境下对凝血酶催化不同肽底物的系统性研究，我们在本文中描述了DNA在变构调节的单体蛋白酶动力学中的复合作用。我们的分子动力学（MD）模拟为实验数据提供了结构上的解释，并支持了我们关于 DNA 在凝血酶催化机制中发挥积极作用的观点。应用过渡态模型能够量化反应在不同情况下的能量分布变化，并为将这些变化转化为不同底物浓度下反应速度的变化提供了关键手段。我们认为，DNA纳米杆不仅仅做为一个被动的支架，它们通过为底物水解提供可替代性路径而积极参与到催化循环中。最终的结果是一个由一系列催化反应构成的网络，在这个网络中，游离的和与 DNA 结合的酶在动力学上是相互关联的，并且由 DNA 引导的物质流动量会与 DNA/酶结合的亲和力以及 DNA/底物的静电相互作用成正比地增加。

02

结果

1、DNA-酶结构的设计

在我们所有的样本中，a-人凝血酶在核酸适配体存在与否下水解荧光标记的肽底物，核酸适配体或者自由扩散到溶液中，或者锚定到固定形状的DNA origami支架上（请见Fig. 1A)。因此，整个系统都可以看作由三个元素构成：酶，底物和DNA微环境，必须考虑相互作用，才能理解在DNA限制环境中发生的催化反应的复杂性。酶是该系统中的唯一恒定成分，其它的两种则会以一定的方式进行变化，以理解它们在催化反应动力学中单独或互相结合的作用。我们使用了三种不同的肽底物，其序列为 FAM-GGfPR|SGGGK(BHQ-1)K-Aaa-OH（其中 f 表示 d-苯丙氨酸残基，Aaa 是可变氨基酸；请见Fig. 1B)。

所有底物都带有一个荧光共振能量转移报告基团（[5-carboxyfluorescein/black hole quencher 1 (FAM/ BHQ-1)]，供体和淬灭荧光基团分别位于肽的P5和P5’的位置。在裂解位点（由竖线表示）处，由凝血酶引发的底物水解会导致染料在空间上分离，并使荧光猝灭现象消失。供体荧光信号的增加便可用于监测反应在时间上的进展情况。三种底物仅在C-末端氨基酸上有所不同：此处分别各自为一个 Gly, Asp, 或Lys，在PH为7时，静电荷分别为中性（0），负电荷（-1）或正电荷（+1）。相应地，三种底物分别表示为S(0），S(-1)和S(+1)。

系统中另外的可变因素是DNA微环境。这种系统性的改变可用于评估不同的结构和电荷因素对酶/底物催化效应的影响。

具体来说，我们使用序列为5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′的含15个碱基的凝血酶结合适配体TBA1和序列为5’-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’含29个碱基的适配体TBA2各自识别凝血酶的exosite I和II位点（请见Fig. 1B)。带有单链延伸部分（请见Fig. 1A中浅蓝色和深蓝色的线段）的适配体的拉长部分与 DNA 皱折表面（请见Fig. 1A中棕色部分）建立了连接。已设计出两种类型的 DNA 纳米结构：单层框架标记为“矩形”；请见Fig. 1C）和双层立方形状（请见Fig. 1E）。

Fig. 1 DNA origami-凝血酶催化系统

2、DNA对凝血酶催化水解的效应

在1nM核酸适配体存在与否的情况下，检测酶反应动力学。一旦添加底物（从0到25M)，通过由于底物裂解产生的随时间变化的荧光信号对酶的裂解活性进行测量（请见Fig. 2D)。所有的实验都在同样的条件下进行，每个底物共14个不同的蛋白水解反应。动力学检测图谱请见Fig. 2C。凝血酶通过三步机制催化氨基键水解，底物的结合（K1）和解离（K-1）后紧接着是不可逆的乙酰化以及去乙酰化（K3）步骤（请见Fig. 2B)。我们所有的速率曲线都符合MM等式（Eq. 1)，高浓度底物时，与DNA Origami-结合的酶受到明显的抑制（texS2)。除了rect flex 1(Fig. 2C中的黄色曲线），在所有经过直角和矩形修饰的结构中都会出现底物抑制现象，当底物浓度高于 5uM时，其速度曲线会呈现出轻微的负斜率这一特征（请见Fig. 2C)。

Fig. 2 凝血酶催化底物S(0）水解的动力学分析

仔细分析由底物S(0)产生的动力学参数，尤其是KM（请见Fig. 3C)，可以区分出三类样本，这取决于是否存在 DNA 以及其与酶的结合程度。这三类样本分别被命名为“无 DNA”、“未结合 DNA”和“结合 DNA”。与其他两组相比，“无DNA“组共同的特征是DNA的缺失，产生相似的KM（3.4 ± 0.2M）和Kcat（65 ± 4 min−1）值。“DNA未结合组”中酶的运动仍旧相对自由，尽管被大量的DNA包围着，这种DNA指的是随意的单链寡核苷酸序列形式或缺少核酸适配体的DNA Origami结构，酶的KM值减少了40%（2.0 ± 0.1 M）以及Kcat值平均高了15%（80 ± 21 min−1）。最后，第三组结构中，酶是固定在DNA Origami结构中，该组中的酶具有更低的KM值(1.1 ± 0.2 M) 以及平均值上更高的Kcat值 (100 ± 14 min−1 )。

假设采用一个简单的MM模型，我们接着运用过渡态理论将反应的动力学参数与参与反应的物质在反应路径上所经历的能量变化联系了起来（请见Fig. 4)。

Fig. 3 凝血酶催化三种底物水解的动力学参数

3、物的静电荷对凝血酶动力学效应

我们使用S(-1)和S(+1)底物进行了同样的酶催化检测（请见Fig. 3,A,B,E,和F）。尽管与凝血酶结合的位点相同，我们期望这些含有不同静电荷的底物具有不同的动力学参数。与 S(0) 相比，在没有 DNA 纳米结构的情况下，底物 S(−1) 的水解反应中，K M值（约为 9 uM）和 Kat值（约为 200 min−1）均显著增加了三倍以上，而底物 S(+1) 的相应值则明显更低（分别为约 0.5uM和45 min−1）。同样，应用过渡态模型有助于从能量角度来解释这一现象（请见Fig. 4）。具体而言，在没有 DNA 的情况下，向底物中添加负电荷（即将底物 S(0) 替换为 S(−1)），会使 ES 复合物的稳定性略微降低，而过渡态几乎保持不变。与之相反，正电荷的添加，例如将底物S(0)替换为S(+1)，产生相反的结果，它将会使ES复合物和过渡态更加稳定，并且前者比后者更加稳定。仔细研究底物静电荷对DNA限制性反应的能量水平的影响也非常具有指导性意义（请见Fig. 4)。当将 S(0) 替换为 S(−1) 时，与没有 DNA 存在时所观察到的相同趋势出现了一致的情况，因此，可以得出类似的结论。而 S(+1) 的表现则完全不同：在此情况下，由于周围存在 DNA环境而产生的正电荷的加入，极大地破坏了 ES 复合物的稳定性，使得过渡态几乎未受影响。这导致了 KM 和 kcat 的显著增加，而 Kcat /KM 的值几乎未受影响。

Fig. 4 S（-1）、S（0）和 S（+1）与凝血酶以及与 DNA 连接的凝血酶的反应能量图

本文中，凝血酶与DNA的结合动力学测量，采用的是switchSENSE技术，发现在存在大量单链 DNA (ssDNA)的情况下，凝血酶仍能保持其结合特异性。